Viene analizzato il modello a circuito equivalente per un citometro ad impedenza ad elettrodi paralleli insieme alla teoria di omogeneizzazione delle miscele di Maxwell. Si affronta sia una modellazione cellulare single shell che double shell.
I risultati mostrano come anche piccoli errori sulla stima dei parametri portano a variazioni nelle previsioni del modello. Inoltre, dal segnale modellato appare evidente la possibilità di differenziare differenti stati biologici a differenti frequenze di analisi.
Il seguente articolo è un estratto di un progetto realizzato per il corso di Modellazione e Simulazione di Sistemi Fisiologici. Tenuto per Ingegneria Medica presso l’Università degli Studi di Roma Tor Vergata.
Introduzione
Lo studio delle proprietà cellulari e dello stato di vita della cellula è fondamentale nella ricerca. Diverse analisi mostrano come cellule con differenti stati vitali mostrano proprietà dielettriche diverse che possono dar luogo a segnali misurati differenti tra loro.
Si affronta la misurazione tramite citometro ad impedenza e l’analisi di un modello semplificato. Tale modello prevede un’equivalente circuitale e si presta per modellare il segnale di picco, con la cellula tra i due elettrodi. Il modello si avvale anche della teoria delle miscele di Maxwell per omogeneizzare le proprietà dielettriche al fine di stimare un’unica permettività complessa e quindi l’impedenza risultate del sistema tramite la quale ricavare il segnale.
Nonostante la semplicità, rispetto altri approcci più completi quali la modellazione FEM, questo approccio permette di ottenere risultati molto veloci e utili alla distinzione tra diverse proprietà dielettriche di membrana. Vengono quindi affrontate la modellazione e l’analisi di come variazioni delle proprietà dielettriche dei singoli costituenti si riflettono sul segnale modellato.
Tali proprietà tipicamente sono specchio dello stato di vita cellulare ed è possibile utilizzare questa modellazione per distinguere segnali provenienti da diverse famiglie cellulari quali cellule apoptodiche, cellule in salute o cellule necrotiche.
Background
La modellazione tramite equivalente circuitale porta in contro la teoria delle miscele di Maxwell (MMT) per modellare le proprietà dielettriche cellulari.
Tale modello permette di descrivere il segnale ottenuto in un citometro ad impedenza ad elettrodi paralleli nel momento in cui la cellula si trova tra una coppia di elettrodi. La presenza della cellula tra gli elettrodi, insieme alla perturbazione del campo elettrico, genera un segnale di corrente differenziale che risulta proporzionale al diametro per il tramite del fattore di Clausis-Mossotti.
Nel seguente report verrà considerata una versione semplificata del segnale, trascurando fattori aggiuntivi legati alle proprietà del circuito di misura, ovvero pari a:
\begin{equation}
S=r^{3} f_{C M}
\end{equation}Equivalenza circuitale
l circuito in fig. 1 prevede l’applicazione di un potenziale agli elettrodi superiori e il campionamento del segnale dagli elettrodi inferiori, come corrente differenziale [1].
Osservando il percorso della corrente essa si troverà a passare per gli elettrodi e poi per il buffer conduttivo, eventualmente anche incontrando la cellula. Ognuno di questi materiali contribuirà con una sua impedenza.
Tali impedenze sono in serie e quindi il segnale misurato sarà:
\begin{equation}
I_{\mathrm{diff}}=\frac{V_{\mathrm{appl}}}{Z_{\mathrm{med}}+2 Z_{d l}}-\frac{V_{\mathrm{appl}}}{Z_{\mathrm{mix}}+2 Z_{d l}}
\end{equation}Dove l’impedenza 𝑍mix rappresenta l’insieme di cellula e buffer conduttivo e verrà descritta più avanti tramite MMT.
Inoltre, in questo segnale, riorganizzando i termini, compare una differenza di impedenza Δ𝑍 = 𝑍mix − 𝑍med pari proprio alla perturbazione indotta dalla cellula. Tale termine inoltre risulta molto minore dell’impedenza del mezzo e questo ci permette di trascurare i termini quadratici e ottenere un segnale di corrente differenziale pari a:
\begin{equation}
I_{\mathrm{diff}} \approx \frac{V_{\mathrm{appl}}}{Z_{\mathrm{med}}^{2}} \frac{Z_{\mathrm{mix}}-Z_{\mathrm{med}}}{\left(1+2 \frac{Z_{d l}}{Z_{\text {med }}}\right)^{2}}
\end{equation}L’impedenza di elettrodo è legata alla capacità superficiale 𝐶𝑑𝑙 e alle dimensioni del volume del canale compreso tra le coppie. Risulta essere pari a:
\begin{equation}
Z_{d l}=\frac{1}{j \omega C_{d l} w l}
\end{equation}L’impedenza del mezzo viene espressa tramite la legge di Ohm, contestualizzandola in funzione del volume del canale:
\begin{equation}
Z_{\text {med }}=\frac{h}{\sigma^{*} l w k}=\frac{1}{\sigma^{*}} \frac{1}{G}=\frac{1}{j \omega \varepsilon^{*}} \frac{1}{G}
\end{equation}Portando in conto anche effetti di distorsione del campo elettrico tramite un coefficiente geometrico 𝐺. In generale, la permittività complessa è esprimibile come:
\begin{equation}
\varepsilon^{*}=\varepsilon+\frac{\sigma}{j \omega}
\end{equation}Tali considerazioni sono analoghe per l’impedenza del mix dove però la 𝜀∗ mix va stimata tramite la teoria delle miscele di Maxwell.
Maxwell’s Mixtures theory
La teoria delle miscele di Maxwell permette di descrivere la permettività complessa di mezzo e cellula in funzione delle loro proprietà [2].
In particolare, si può esprimere la permettività in funzione del fattore di Clausius-Mossotti come:
\begin{equation}
\varepsilon_{\text {mix }}^{*}=\varepsilon_{\text {med }}^{*} \frac{1+2 \varphi f_{C M}}{1-\varphi f_{C M}}
\end{equation}A sua volta questo fattore si esprime in funzione delle proprietà della cellula:
\begin{equation}
f_{C M}=\frac{\varepsilon_{\text {cell }}^{*}-\varepsilon_{\mathrm{med}}^{*}}{\varepsilon_{\mathrm{cell}}^{*}+2 \varepsilon_{\mathrm{med}}^{*}}
\end{equation}Mettendo insieme quanto descritto si ottiene l’espressione per la corrente differenziale in eq. (3), in funzione del fattore di Clausius-Mossotti:
\begin{equation}
I_{d i f f} \approx-\frac{V_{\text {appl }}}{Z_{\text {med }}} \frac{1}{\left[1+\frac{2 Z_{d l}}{Z_{\text {med }}}\right]^{2}} 3 \varphi f_{C M}
\end{equation}Dove 𝜑 è la volume fraction che porta in conto il volume della cellula come:
\begin{equation}
\varphi=\frac{V_{\text {cell }}}{V_{\text {misura }}}=\frac{\frac{4 \pi r^{3}}{3}}{l w h K}
\end{equation}E il segnale misurato, trascurando i contributi dispersivi legati agli elettrodi, risulta proporzionale a 𝑟3 (tramite la volume fraction) e al fattore di Clausius-Mossotti.
Shell model
Avendo visto come portare in conto le proprietà miste di cellula e mezzo non rimane che analizzare come omogeneizzare le proprietà della singola cellula. Le cellule vengono omogenizzate ad un unico materiale avente proprietà 𝜀∗ cell e tale da portare in conto sia le proprietà della parte interna che della membrana cellulare.
Per cellule prive di nucleo, come i globuli rossi, è possibile utilizzare un modello single shell, basato quindi su una membrana esterna sottile ed una zona interna le cui proprietà vengono omogeneizzate come:
\begin{equation}
\varepsilon_{c e l l}^{*} \approx \varepsilon_{i n t}^{*} \frac{\chi}{1+\chi}
\end{equation}Dove:
\begin{equation}
\chi=\frac{\varepsilon_{m e m}^{*} / d_{m e m}}{\varepsilon_{i n t}^{*} / r}
\end{equation}Per cellule più grandi e complesse è necessario considerare un modello più accurato come il double shell dove vengono considerate quattro differenti zone. Si considera una zona interna, corrispondente al nucleo, (np) e la sua membrana ne. A queste si aggiunge il citoplasma cyt e la membrana cellulare mem. In particolare, si effettuano delle omogenizzazioni in sequenza partendo dalla zona centrale.
Applicando una relazione analoga a eq. (11) si arriva a stimare le proprietà complessive del nucleo (nuc). Successivamente queste possono essere unite proprio tramite la MMT descrivendo così l’interno cellulare (int). Infine, si ripete l’omogenizzazione (eq. (11)) tra la zona interna e la membrana ottenendo così una permittività complessa per l’intera cellula.
| Flag | radius [m] | sgm_mem [S/m] | sgm_int [S/m] | eps_int |
|---|---|---|---|---|
| bead | 3 E-6 | 1 E10 | 2.7 E-3 | 2.5 ε0 |
| viable | 9 E-6 | 0 | 0.6 | 60 ε0 |
| necrotic | 9 E-6 | 1 E-3 | 0.6 | 60 ε0 |
| apoptotic intact | 3 E-6 | 0 | 0.6 | 60 ε0 |
| apoptotic permeable | 3 E-6 | 1 E-3 | 0.6 | 60 ε0 |
Risultati
Vengono quindi applicati questi modelli per stimare segnali di citometria ad impedenza di diverse famiglie cellulari in stato vitale, necrotico e apoptotico [3]. I parametri utilizzati, da De Ninno et al., sono riportato in Tab. 1.
Al fine di rappresentare la fisica del problema sono state utilizzate, all’interno di Matlab, le variabili di classe struttura. Tali variabili permettono l’aggiunta di alcuni campi e quindi si è utilizzata la sequenza dei campi per rappresentare le proprietà possedute dalla struttura madre. Ad esempio, la permettività della membrana cellulare sarà il campo 𝚎𝚙𝚜 della struttura 𝚖𝚎𝚖 a sua volta figlia di 𝚌𝚎𝚕𝚕.
Uno schema grafico è presente, per la formulazione double shell, in fig. 4, e un esempio in appendice. Tale struttura, oltre ad essere rappresentativa dell’elemento fisico che possiede tale proprietà, permette di iterare alcune procedure andando a prendere i singoli campi di diverse strutture e di realizzare un codice modulare e facilmente estensibile ed aggiornabile. Il codice prevede una routine principale main.m e diverse routine ausiliarie.
I dati vengono caricati tramite la routine data(flag) passando la flag indicata in Tab. 1 per ottenere i relativi parametri e le strutture 𝚌𝚎𝚕𝚕 e 𝚖𝚎𝚍. La routine principale itera sulle differenti flag per poi ottenere il segnale in fig. 3. Per ogni iterazione, dopo aver richiamato le proprietà materiali, queste vengono passate alla routine 𝚎𝚚𝚞𝚒𝚟𝚊𝚕𝚎𝚗𝚝𝚎𝙲𝚒𝚛𝚌𝚞𝚒𝚝𝙼𝚘𝚍𝚎𝚕.𝚖 che si occupa di modellare il circuito equivalente e restituire il segnale come in eq. (1) e la permettività complessa omogeneizzata (eq. (7), tramite 𝚏𝚌𝚖_𝚖𝚒𝚡()). Per farlo necessita del calcolo delle proprietà omogeneizzate della cellula e del fattore di Clausius-Mossotti.
Calcolo del fattore di Clausius-Mossotti
Il fattore di Clausius-Mossotti viene calcolato tramite una routine corrispondente. L’omogeneizzazione delle proprietà cellulari viene effettuata tramite la routine MMT.m che viene suddivisa, tramite il campo 𝚌𝚎𝚕𝚕.𝚜𝚑𝚎𝚕𝚕 nell’implmentazione single shell o double shell. Tale routine, oltre a calcolare le relative quantità complesse per il tramite della routine epstile.m calcola l’omogeneizzazione per il tramite della subroutine mixture.m che applica l’eq. (11).
Dal segnale ottenuto è possibile ricavare il diametro elettrico come la radice cubica del modulo e i risultati sono presenti in fig. 3a, insieme alla fase del segnale in fig. 3b. Dall’analisi dei grafici è possibile identificare differenti peculiarità a seconda delle famiglie che si vogliono distinguere. Effettuando misurazioni a differenti frequenze sarà possibile distinguere tra diversi stati vitali nella popolazione analizzata.
Modello double-shell
Per l’implementazione double-shell è sufficiente inserire i campi richiesti per le proprietà cellulari. I parametri utilizzati, noti in letteratura [4], sono presenti in Tab. 2. Inseriti i parametri nelle proprietà della struttura 𝚌𝚎𝚕𝚕, la routine MMT() si occupa di fare la doppia omogeneizzazione e restituirne i valori della 𝜀∗ mix.
| cell | .np | .ne | .cyt | .mem |
|---|---|---|---|---|
| .eps ε0 | 77 | 40 | 1 E10 | 77 |
| .sgm [S/m] | 1 | 4 E-4 | 1 | 8 E-8 |
Tali valori sono graficati per il tramite della routine mix_plot() che si occupa di normalizzare i valori e restituire i grafici di 𝜀 e 𝜎 presente in fig. 5.
Influenza delle variazioni dei singoli parametri
Inoltre, si analizza l’influenza delle perturbazioni sugli otto parametri descrittivi del modello double shell. Le variazioni vengono effettuate secondo Irimajiri, Hanai, and Inouye [4].
Vengono quindi caricati i dati delle perturbazioni tramite la struttura 𝚙𝚎𝚛𝚝𝚞𝚛𝚋𝚊𝚝𝚒𝚘𝚗_𝚟𝚊𝚕𝚞𝚎𝚜.𝚍𝚊𝚝𝚊 e viene iterata la stessa procedura sugli otto parametri. Il risultato è presente in fig. 6. Un esempio della procedura di iterazione è presente in appendice.
Dai grafici è possibile vedere come il comportamento a bassa frequenza viene influenzato principalmente dalla variazione degli strati esterni con predominanza per le proprietà di membrana. Ad alta frequenza la permettività viene influenzata poco e principalmente variando le proprietà di citoplasma e nucleo mentre la conduttività risente molto delle variazioni delle proprietà di citoplasma e nucelo. Nella banda centrale la pendenza delle curve risente notevolmente della variazione di 𝜎cyt. In generale, le variazioni delle proprietà di conduttività hanno effetti maggiori sulla permettività complessa omogeneizzata.
Conclusioni
Tali evidenti variazioni delle proprietà omogeneizzate possono essere utilizzate per estrarre informazioni dai segnali di citometria al fine di analizzare lo stato di vita cellulare.
Differenti proprietà misurate forniscono segnali diversi ed è possibile utilizzare tale teoria per risalire dal segnale alla differenziazione tra diversi stati cellulari.
Tramite l’analisi del modello a circuito equivalente con la teoria delle miscele di Maxwell è possibile capire a quale frequenza effettuare le misurazioni a seconda delle popolazioni cellulari che si vuole misurare.
Disponibilità del codice
Il codice è disponibile alla repository GitHub del progetto.
Riferimenti
- [1] Carlos Honrado et al. “Single-Cell Microfluidic Impedance Cytometry: From Raw Signals to Cell Phenotypes Using Data Analytics”. In: Lab on a Chip 21.1 (2021), pp. 22–54. ISSN: 1473-0197, 1473-0189.
- [2] T. Hanai, N. Koizumi, and A. Irimajiri. “A method for determining the dielectric constant and the conductivity of membrane-bounded particles of biological relevance”. en. In: Biophysics of Structure and Mechanism 1.4 (1975), pp. 285–294. ISSN: 0340-1057, 1432-1017. DOI: 10 . 1007 / BF00537642.
- [3] Adele De Ninno et al. “High-throughput label-free characterization of viable, necrotic and apoptotic human lymphoma cells in a coplanar-electrode microfluidic impedance chip”. en. In: Biosensors and Bioelectronics 150 (Feb. 2020), p. 111887. ISSN: 09565663.
- [4] Akihiko Irimajiri, Tetsuya Hanai, and Akira Inouye. “A dielectric theory of “multi-stratified shell” model with its application to a lymphoma cell”. en. In: Journal of Theoretical Biology 78.2 (May 1979), pp. 251269.
Appendice
Caricamento dei dati all’interno della struttura
A seguire uno snippet estratto dalla procedure data.m all’interno di uno switch-case sulla variabile 𝚏𝚕𝚊𝚐. Tale sezione di codice permette di caricare le strutture 𝚌𝚎𝚕𝚕 e 𝚖𝚎𝚍 con i loro campi contenenti le proprietà dielettriche e geometriche, insieme alla flag double che permetterà, alle relative subroutine, di effettuare l’omogeneizzazione di tipo double shell.
case ’double’
cell.shell=’double’;
mem.thickness=80*1e-10; %[m]
cell.radius=6.5*1e-6; %[m]
int.radius=cell.radius;
mem.sgm=8e-7*1e-1; %[S/m]
mem.eps= 9*eps0;
int.sgm=0.6;
int.eps=60*eps0;
cell.int=int;
cell.mem=mem;
cell.np.radius=4.67*1e-6;
cell.ne.thickness=400*1e-10;
cell.np.sgm=10*1e-1;
cell.np.eps=77*eps0;
cell.ne.sgm=4e-3*1e-1;
cell.ne.eps=40*eps0;
cell.cyt.sgm=10*1e-1;
cell.cyt.eps=77*eps0;
med.sgm= 1;
med.eps= 77*eps0;
cell.volfrac=0.1;
cell.nuc.volfrac=(cell.np.radius/cell.radius)^3;Perturbazione
Esempio di iterazione per la perturbazione della permettività della membrana cellulare. Viene riportato lo snippet della variazione di 𝜀mem. Una sequenza analoga viene utilizzata anche sugli altri 7 parametri analizzati.
% load pertubation values
pert=perturbation_values.eps.mem;
% string for reference
perturbation=’{\epsilon}_{mem}’;
real_value=cell.mem.eps/eps0; % create figure and plot
eps_mem_pert=figure();
cell_pert=cell;
for i=1:length(pert)
% change perturbation properties
cell_pert.mem.eps=pert(i);
[~,~,cell_pert,epstile_mix_pert]=equivalentCircuitModel(med,cell_pert,frequency_span);
mix_plot(eps_mem_pert ,epstile_mix_pert ,frequency_span ,omega ,{colorType1{i},colorType2{i}})
clear epstile_mix_pert
end
% resize figs
eps_mem_pert.Position = [100 100 800 400];
lg=legend(strcat(’=’," ",string([pert/eps0,pert/eps0])),’Location’,’eastoutside’);
lg.Title.String=strcat(perturbation ,’ = ’,num2str(real_value),’ [S/m]’); title(strcat(’Pertubation over’," ",perturbation))
